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唾液彎曲桿菌探針?lè )晒舛縋CR試劑盒檢測方法包括以下步驟:
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接,克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上,構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品,并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn);
(2)待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增后,目的基因與參照基因按照各自的標準曲線(xiàn)計算各自的拷貝數,計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值,即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。
其中步驟(1)為:將參照基因與待測目的基因片段等比例連接,克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上,構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品,并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn)。
其中所述參照基因為本領(lǐng)域常規參照基因,較佳地管家基因,優(yōu)選地為RPPH1的擴增區域,其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規質(zhì)粒載體,較佳地為PCR克隆載體,優(yōu)選地為T(mén)A cloning載體,所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1:1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1,解決了目前相對標準曲線(xiàn)法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問(wèn)題,提高HER2基因擴增檢測的可靠性。