兔粘液瘤病毒PCR檢測(cè)試劑盒說明書

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

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實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
 Silicic acid乙基三苯基化膦 95%DL-α-酚 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Silicotungstic acid hydrate甲基三苯基溴化鏻 98%*基氫醌 98%

Tungstic acid四甲基化銨 98%D-α-酚醋酸酯 96%

2-Butynedioic acid四甲基氫氧化銨 AR,25%溶液L-賴氨酸甲酯鹽酸鹽 98%

α-Bromoisobutyric acid四丁基氯化銨 離子色譜級(jí), ≥99.0%苯甲 AR，99%

Chrysophanic acid四丁基氯化銨 97%草酸二甲酯 CP，98%

Cinnamic acid四乙基氫氧化銨 AR,25%溶液馬來酸二乙酯 96%

Citrazinic acid四乙基氫氧化銨 AR,25%甲溶液1,4-二甲氧基苯 99%

Tricyanic acid三鹽酸鹽 98%1,4-二甲氧基苯 ≥99%,FCC

1,1-Cyclobutanedicarboxylic acid四丁基氫氧化銨溶液 ～25% in H2O (～0.8 M)間苯二甲 98%

trans-Ferulic acid四丁基氫氧化銨溶液 10% in H2O馬來酸二甲酯 98%

Ferulic acid四丁基氫氧化銨溶液 ～25% in methal (～0.8 M)乙酯 AR,99%

Heptadecaic acid四丁基硫酸氫銨 98%苯乙 CP

Heptaic acid四丁基硫酸氫銨 離子對(duì)色譜苯乙 GR,99%

Trans-2-Hexeic acid四丁基溴化磷 98%甲氧基乙酸甲酯 99%

Itaconic acid三乙胺鹽酸鹽 for HPLC, ≥99.0%1-萘甲  98%

紐莫康定B0(肺囊康定) Syk (D3Z1E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)PTP1B  蛋白酪氨酸磷酸酶-1B

福莫特羅 Syk (D3Z1E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)PTP/PTPase/CD148  蛋白酪氨酸磷酸酶CD148抗體

溴甲后馬托品p27 Kip1 (D69C12) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)PTOV1  前列腺腫瘤高表達(dá)蛋白1抗體

乙酸阿比特龍酯CD13/APN (E1Y7U) Rabbit mAbPTOP  腎上腺皮質(zhì)發(fā)育異常同源蛋白抗體

溴莫尼定 Syk (D3Z1E) XP® Rabbit mAb (Pacific Blue™ Conjugate)PTN/Pleiotrophin  多效生長(zhǎng)因子抗體

磺草靈PSMB8/LMP7 (1A5) Mouse mAbPTK9/TWF1  蛋白酪氨酸激酶9抗體

磺草靈(標(biāo)準(zhǔn)品)β-Catenin (D10A8) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)PTHrP/PTHLH  甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白抗體

苯磺酸貝托司汀MOB1 (E1N9D) Rabbit mAbPTGEs  前列腺素E合成酶抗體

葉綠素銅鈉鹽GABARAP (E1J4E) Rabbit mAbPTGER1  前列腺素EP1受體抗體

新綠原酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Progesterone Receptor (Ser294) AntibodyPTEN/MMAC1(NT)  一種腫瘤抑制基因抗體（N端）
兔粘液瘤病毒PCR檢測(cè)試劑盒說明書人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1公斤

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