立克次體通用PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Dimethylglyoxime disodium salt octahydrate2,4-二氯 98%二甲基烯酸甘油酯 90%

1,3-Diphenylurea對(duì)甲 97%甲基烯酸己酯 98%

Dithiooxamide對(duì)甲 ≥97%,Kosher二甲基烯酸1,6-己二酯 95%

Domoic acid對(duì)甲 99%二烯酸1,6-己二酯 90%

Ferene S3-氨基-4-甲氧基-N-苯基苯甲酰胺 98%甲基烯酸羥乙酯 96%

Fluorene鄰甲氧基苯胺 GR,99%甲基烯酸異癸酯 98%,含150ppm MEHQ穩(wěn)定劑

5-Hydroxymethylfurfural2-氨基-4-硝苯 98%甲基烯酸異冰片酯 85-90%,含150-200 ppm MEHQ穩(wěn)定劑

Hexaamminecobalt(III) chloride2-氨基-4-硝苯 分析標(biāo)準(zhǔn)品二甲基烯酸新戊二酯 90%

HistoChoice® Dermatology Fixative對(duì)甲氧基苯胺 AR，99.0% 二烯酸新戊二酯 89%

HistoChoice® MB tissue Fixative4-氯-2-胺 99%甲基烯酸十八烷基酯 96%

HistoChoice® clearing agent對(duì)氯苯胺 98%三乙二二甲基烯酸酯 95%，stabilized with 60-100 ppm MEHQ

HistoChoice® mounting media2,5-二氯苯胺 98%二甲基烯酸四乙二酯 包含~0.006% 對(duì)苯二酚 穩(wěn)定劑, 90%

Iodoacetyl LC Biotin2,5-二氯 99%烯酸四酯 98%,含500ppm氫醌單甲MEHQ穩(wěn)定劑

Ferrous oxalate dihydrate4-(2-羥乙基)-1-哌磺酸 ≥99.0% (T) 甲基烯酸四酯 97%

Ferric tartrate2-甲基-4-胺 99%二甲基烯酸鋅 95%

Lanthanum acetate hydrate4-甲基-2-胺 98%2-萘胺-1-磺酸 98%

EDTA,乙二胺四乙酸M-RIP (D8G8R) Rabbit mAbPI3 Kinase p110 beta  磷脂酰肌激酶（PI3Kβ）抗體

咪唑Eg5 (E1L3W) Rabbit mAbPI 3 Kinase p85 beta  磷脂酰肌激酶p85β抗體

L(+)-阿拉伯糖NRF2 (D1Z9C) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)PHYH  植烷酸氧化酶抗體

去離子甲酰胺Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (Pacific Blue™ Conjugate)phospho-β catenin(Tyr142)  磷酸化β 連環(huán)素蛋白抗體

石蠟油Ras (G12V Mutant Specific) (D2H12) Rabbit mAbPhospho-Zyxin (Ser142/Ser143)  磷酸化斑聯(lián)蛋白抗體

乙酸Nav1.5 (D9J7S) Rabbit mAbPhospho-Zap-70(Tyr493)  磷酸化zeta相關(guān)蛋白70抗體

無(wú)乙酸鈉Zap-70 (D1C10E) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)Phospho-Zap-70 (Tyr315/Tyr319)  磷酸化zeta相關(guān)蛋白70抗體

氯化c-Myc (D84C12) Rabbit mAb (Pacific Blue™ Conjugate)phospho-YWHAE(Thr232)  磷酸化14-3-3E蛋白抗體

低熔點(diǎn)瓊脂糖；具有低凝膠溫度的瓊脂糖Ras (G12D Mutant Specific) (D8H7) Rabbit mAbphospho-YES1(Tyr537)  磷酸化原癌基因酪氨酸蛋白激酶Yes1抗體

無(wú)磷酸二氫SF3B1 (D7L5T) Rabbit mAbphospho-YES1(Tyr426)  磷酸化原癌基因酪氨酸蛋白激酶Yes1抗體
立克次體通用PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)兔血清總補(bǔ)體(CH50)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1米

兔血栓素B2(TXB2)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

兔血纖蛋白原(Fbg)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

兔氧化低密度脂蛋白抗體(OLAb)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：500毫升

兔一氧化氮()ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：200張/盒

兔一氧化氮合成酶(S)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃1克

兔胰淀素(Amylin)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：

兔乙酰膽堿(ACh)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。